Распределительная хроматография. Бумажная хроматография. Осадочная хроматография. Понятие оситовой (эксклюзионной) хроматографии. Гель-хроматография.

Распределительная хромотография.

хроматографический метод, при котором неподвижная (стационарная) фаза химически связана с поверхностью неподвижного носителя. Подвижной фазой является жидкость, которая служит растворителем, или газ (газовая хроматография). Разделение происходит за счёт различия полярности разделяемых веществ. При распределительной хроматографии носитель пропитывается одним из растворителей (“неподвижный растворитель”), а другой растворитель (“подвижный ”) пропускают через колонку носителя. В качестве неподвижного растворителя чаще всего берут воду или другие полярные жидкости (серную кислоту, метиловый спирт и т.д.); в качестве подвижного растворителя - менее полярные жидкости, не смешивающиеся с первыми во всех соотношениях. Порцию исследуемой смеси веществ, растворенную в подвижном растворителе, вводят в колонку и после того, как раствор впитается верхней частью колонки, начинают промывание колонки чистым подвижным растворителем. В процессе промывания происходит непрерывное перераспределение веществ смеси между двумя несмешивающимися жидкими фазами. Так как разные компоненты смеси имеют различные коэффициенты распределения, скорость передвижения отдельных компонентов различная. Наибольшей скоростью движения будет обладать тот компонент смеси, который имеет наибольший коэффициент распределения: C

C = неподв.

т.е. отношение концентраций растворенного вещества в подвижной фазе к его концентрации в неподвижной фазе.

Одним из основных условий получения четкого разделения смеси методом распределительной хроматографии является практическое отсутствие какого-либо взаимодействия компонентов смеси с носителем. Если это условие соблюдается, то при промывании колонки происходит полное разделение смеси. Число носителей, пригодных для распределительной хроматографии, крайне ограничено. Более или менее удовлетворительными качествами обладают такие носители, как особым образом, приготовленный силикагель, очищенный крахмал, целлюлоза.

Бумажная хромотография.

берется полоса фильтровальной бумаги длиной 30-50 см и шириной 1,5 см. На один из концов этой полосы на некотором расстоянии от края наносится капля смеси анализируемых веществ. Затем этот конец бумаги опускается в ванночку, содержащую органический растворитель, насыщенный водой. При медленном продвижении растворителя через поры бумаги происходит непрерывное перераспределение веществ смеси между двумя жидкими фазами. Если разные компоненты смеси имеют различные коэффициенты распределения, то скорость продвижения отдельных компонентов смеси будет различной. Движение подвижного растворителя по бумаге может быть как нисходящим, так и восходящим. После того, как хроматографирование заканчивается, полосу бумаги высушивают и затем проявляют реактивом, дающим цветную реакцию с анализируемыми соединениями. Полученная хроматограмма представляет собой совокупность цветных пятен, расположенных в определенном порядке вдоль полосы бумаги.

Рис. 22. А - восходящая хроматограмма; Б - нисходящая хроматограмма; 1 - сосуд для хроматографирования; 2 - резервуар с растворителем; 3 - хроматографическая бумага; 4 - стартовые точки; 5 - разделенные компоненты; 6 - фронт растворителя.

При нисходящей хроматографии растворитель движется вниз по бумаге из расположенного в верхней части сосуда резервуара с растворителем. Таким способом можно элюировать отдельные компоненты. Наиболее распространенные системы растворителей: СН3СООН-Н2O (15:85 объем), 1-бутанол - СН3СООН-Н20 (4:1:5), 2-пропанол - NH3 (конц.) - Н2O (9:1:2), 1-бутанол - 1,5 н. NH3 (1:1), фенол - вода и др. Состав подвижной фазы обычно подбирают экспериментально или ориентируясь на данные, приведенные в справочниках или монографиях по бумажной хроматографии.

Осадочная хроматография - метод хроматографии, основанный на способности разделяемых веществ образовывать малорастворимые соединения с различными произведениями растворимости. В качестве неподвижной фазы выступает инертный носитель, покрытый слоем осадителя; разделяемые вещества, находящиеся в подвижной фазе, вступают во взаимодействие с осадителем и образуют малорастворимые вещества - осадки. При дальнейшем пропускании растворителя происходят поочерёдно: растворение этих осадков, перенос вещества по слою неподвижной фазы, снова осаждение и т. д. При этом скорость перемещения осадка по неподвижной фазе пропорциональна его произведению растворимости (ПР). Хроматограммой в данном случае будет являться распределение осадков по слою носителя. В качестве примера можно привести разделение галогенид-ионов на носителе (силикагель, целлюлоза и т. д.), пропитанном солью серебра. Можно использовать для разделения осадков их неодинаковую растворимость в различных растворителях или в растворах с различной ионной силой. Реализуется как в колоночном, так и в плоскостном варианте.

Гель-фильтрация или эксклюзионная хроматография (ситовая, гель-проникающая, гель-фильтрационная хроматография) - разновидность хроматографии, в ходе которой молекулы веществ разделяются по размеру за счёт их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми выходят из колонки наиболее крупные молекулы (бо́льшей молекулярной массы), способные проникать в минимальное число пор стационарной фазы. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры. В отличие от адсорбционной хроматографии, при гель-фильтрации стационарная фаза остается химически инертной и с разделяемыми веществами не взаимодействует. В колонку вносят раствор образца, объём которого является лимитирующим для качества хроматографии. Для аналитических разделений он не должен превышать 0,1 % от CV (общего объёма колонки), а для препаративной очистки он должен быть не выше 8-10 % от CV. Колонка упакована порошком, частицы или гранулы которого имеют поры определенного диаметра. Высокомолекулярные вещества, не входящие в поры, проходят между гранулами, поэтому их объём удержания равен объёму колонки за вычетом объёма стационарной фазы (так называемый, свободный объем). Они элюируются первыми. Молекулы средних размеров помещаются в поры сорбента, но не полностью. Поэтому их объём удержания несколько выше свободного объёма. Они элюируется вторыми. Самые мелкие молекулы свободно входят в поры вместе с молекулами растворителя. Поэтому их объём удержания в колонке намного выше свободного и приближается к общему объёму колонки (то есть 100 % CV). Они элюируются последними.

Качественный химический анализ. Классификация методов качественного анализа (дробный и систематический, макро-, полумикро-, микро-, ультрамикроанализ). Аналитические реакции и реагенты, используемые в качественном анализе (специфические, селективные, групповые). Использование качественного анализа в фармации.

Качественный анализ - идентификация (обнаружение) компонентов анализируемых веществ и приблизительная оценка количества их содержания в веществах и материалах. В качестве компонентов могут быть атомы и ионы, изотопы элементов и отдельные нуклииды, молекулы, функциональные группы и радикалы, фазы и т.д.

Классификация методов Метод анализа выбирают в зависимости от предполагаемого содержания вещества и от предела обнаружения применяемой реакции. В настоящее время при изучении качественного химического анализа в учебных лабораториях применяется полумикроанализ.

Хроматографический процесс, протекающий на листе фильтровальной бумаги при перемещении по ее капиллярам и поверхности подвижной фазы,

называется хроматографией на бумаге.

Неподвижной фазой является либо сама бумага, либо вещества, пред-

варительно нанесенные на ее волокна. Механизм хроматографии на бумаге может быть распределительным, адсорбционным или ионообменным. Пере-

мещение подвижной фазы происходит либо только под действием капилляр-

ных сил (восходящая хроматография), либо под действием капиллярных сил и силы тяжести (нисходящая хроматография).

При хроматографировании анализируемые вещества образуют на бу-

маге круглые или овальные пятна (зоны). Совокупность пятен, полученных при хроматографировании данного анализируемого образца, называется хро-

матограммой.

Подвижность вещества при хроматографировании характеризуется ве-

личиной R f , представляющей собой отношение расстояния от линии старта до центра пятна определяемого вещества к расстоянию от линии старта до линии фронта подвижной фазы (см. ОФС «Хроматография»).

Подлинность анализируемого вещества определяется при одновремен-

ном хроматографировании на одном листе бумаги анализируемого и стан-

дартного вещества. Если образцы идентичны, соответствующие им пятна на хроматограммах имеют одинаковый вид и равные значения R f . Для иденти-

фикации иногда целесообразно хроматографировать смесь равных количеств анализируемого и стандартного вещества. На хроматограмме должно набл ю-

даться одно пятно. Условия хроматографирования следует подбирать так,

чтобы значения R f были отличны от 0 и 1.

При испытаниях на чистоту примеси и основное вещество должны иметь разные значения R f . При этом можно судить о степени чистоты анали-

зируемого вещества по величине и интенсивности окраски (или поглощения)

обнаруживаемых на хроматограмме пятен примесей. Содержание примесей может быть определено полуколичественно. Для этого на одном листе бума-

ги одновременно хроматографируют определенное количество анализируе-

мого вещества и несколько образцов определяемой примеси (свидетеля) c

различными, точно известными концентрациями. Содержание примеси в анализируемом образце оценивают, сравнивая ее пятно на хроматограмме по совокупности площади пятна и интенсивности окраски (или поглощения) с

пятнами свидетеля. При достаточном сходстве пятен примеси по форме и ок-

раске с пятнами основного вещества, взятого в том же количестве, допуска-

ется использование соответствующих количеств основного вещества в каче-

стве свидетеля.

Для количественного анализа применяют спектрофотометрические или видеоденситометры. Для обработки хроматограмм в видимой области спе к-

тра целесообразно использовать планшетные сканеры и соответствующее программное обеспечение.

Можно также провести количественное определение веществ после их экстракции с хроматограммы. Для этого пятна вырезают и экстрагируют оп-

ределяемое вещество. Содержание анализируемого вещества в извлечении или сухом остатке после отгонки растворителя находят любым методом,

пригодным для определения малых концентраций.

ОБОРУДОВАНИЕ

Для проведения хроматографии на бумаге используют герметизиро-

ванные камеры, изготовленные из инертного материала и позволяющие на-

блюдать за ходом процесса разделения при закрытой крышке камеры. Часто в качестве камер используют стеклянные стаканы или цилиндры с пришли-

фованной крышкой и дополнительно герметизированные. На крышке могут быть входные отверстия (шлюзы) для добавления растворителя или снятия избыточного давления в камере.

При проведении нисходящей хроматографии в верхней части камеры помещают сосуд для подвижной фазы (лодочку). Лодочка должна вмещать объем подвижной фазы, достаточный для проведения, по крайней мере, од-

нократного хроматографирования. Длина лодочки должна превышать шири-

ну листа хроматографической бумаги. Камера должна быть снабжена уст-

ройствами для закрепления листа хроматографической бумаги в рабочем по-

ложении и для ввода в лодочку подвижной фазы.

При проведении восходящей хроматографии подвижную фазу поме-

щают либо в лодочку, установленную в нижней части камеры, либо налива-

ют на дно камеры.

Внутренние стенки камеры обкладывают фильтровальной бумагой, что способствует более быстрому и полному ее насыщению парами растворите-

лей, входящих в состав подвижной фазы.

Подготовку оборудования, хроматографической бумаги и подвижной фазы приводят в частных фармакопейных статьях.

1.2. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (ОФС 42-0094-09)

Хроматографический процесс в тонком слое сорбента, нанесенном на инертную твердую подложку (стеклянную, металлическую или полимер-

ную), называется тонкослойной хроматографией или хроматографией в тон-

ком слое сорбента (ТСХ).

Разделение может осуществляться по нескольким механизмам: адсорб-

ционному, распределительному, ион-парному, ионообменному, эксклюзион-

ному (гель-проникающему), хиральному или какой-либо их комбинации.

В результате движения анализируемого вещества и элюента под дейст-

вием капиллярных сил происходит разделение смеси исследуемых веществ на ее компоненты. При разделении вещества образуют на поверхности сор-

бента круглые или эллипсовидные пятна или полосы (хроматографические зоны).

Подвижность вещества при разделении характеризуется величиной R f

и R s (см. ОФС «Хроматография», уравнение 6 и рис. 1.4).

Параметры R f и R s используются для идентификации веществ и для оценки разделительной способности системы.

Испытание на подлинность (идентификация) анализируемых ве-

ществ проводится при одновременном хроматографировании одинакового количества анализируемого вещества и стандартного образца на одной и той же хроматограмме. При этом если вещества идентичны, то соответствующие им хроматографические зоны имеют одинаковую форму, интенсивность по-

глощения или окраски и равные величины R f .

При испытаниях на чистоту основное вещество и примеси в условиях хроматографирования должны иметь разные значения R f . При этом можно судить о степени чистоты анализируемого вещества по величине и интенсив-

ности пятен обнаруживаемых на хроматограмме примесей. Их содержание может быть определено полуколичественно. Для этого на пластинку наносят определенные количества анализируемого вещества и свидетелей. Для опре-

деления идентифицированных примесей в качестве свидетелей используют стандартные образцы идентифицированных примесей в количествах, соот-

ветствующих их предельному содержанию. Для определения неидентифици-

рованных примесей чаще всего используют растворы сравнения, приготов-

ленные путем разведения испытуемого раствора, как указано в частной фар-

макопейной статье. Содержание примеси в анализируемом веществе оцени-

вают, сравнивая зону примеси по совокупности величины и интенсивности с соответствующими пятнами свидетеля.

Количественное определение веществ на хроматограмме проводят,

как правило, денситометрически.

Основные приборы и материалы:

– пластинки с закрепленным слоем сорбента различных модификаций;

– хроматографические камеры;

– калиброванные капилляры и микрошприцы;

– устройства для нанесения на хроматограммы обнаруживающих реаген -

тов (пульверизаторы для опрыскивания, камеры для погружения хро-

матограмм в раствор и др.);

– вещества-стандарты, растворители, реагенты для обнаружения хрома-

тографических зон;

ультрахемископы с УФ-лампами на 254 нм и 365 нм.

Используемая лампа должна удовлетворять следующему тесту.

Проверка работы лампы. На пластинку силикагель G наносят 5 мкл

0,04 % раствора натрия салицилата в спирте 96 % для ламп с максимумом и з-

лучения при 254 нм или 5 мкл 0,2 % раствора натрия салицилата в спирте

96 % для ламп с максимумом излучения при 365 нм в виде пятна диаметром около 5 мм; пятно должно светиться.

При проведении анализов расстояние между лампой и хроматографи-

ческой пластинкой не должно превышать расстояния, используемого при проверке работы лампы.

Примечание. Используемый спирт должен быть свободен от флуоресцирующих веществ.

Хроматографические пластинки

Пластинка для ТСХ представляет собой твердую подложку (стеклян-

ную, металлическую или полимерную) с нанесенным слоем сорбента. Тол-

щина слоя сорбента от 0,1 до 0,25 мм для аналитического варианта и от 0,5

до 2,0 мм для препаративного.

Готовые хроматографические пластинки могут содержать флуоресци-

рующий индикатор для детектирования веществ, поглощающих в УФ-

области спектра при 254 и 365 нм.

Размер частиц сорбента для аналитического варианта ТСХ составляет

5–20 мкм. Наряду с такими пластинками можно использовать высокоэффек-

тивные хроматографические пластинки, содержащие сорбент с частицами размером 5–7 мкм. Такие пластинки позволяют увеличить эффективность разделения и уменьшить предел обнаружения хроматографических зон.

Выпускаются также пластинки с монолитными сорбентами и пластин-

ки с концентрирующей зоной (двухфазовые пластинки). Последние исполь-

зуются в фармацевтическом анализе для разделения сложных и гетерогенных смесей (экстракты из растительного лекарственного сырья, растворы табле-

ток со вспомогательными компонентами, мягкие лекарственные формы, сме-

Хроматографические камеры

Используют хроматографические камеры для вертикального или гори-

зонтального элюирования с герметичными крышками. Камеры для горизон-

тального элюирования снабжены также устройствами для подачи элюента на пластинку. Перед проведением анализа обычно внутренние стенки камеры обкладывают фильтровальной бумагой, смоченной подвижной фазой. Для вертикального элюирования применяют камеры с перегородкой в центре дна.

Использование камеры для горизонтального элюирования позволяет осуществлять одновременное элюирование с противоположных сторон пла-

стинки, что увеличивает производительность анализа в два раза по сравне-

нию с использованием камеры для вертикального элюирования. При этом также уменьшается расход подвижной фазы приблизительно в 10 раз. В го-

ризонтальной камере движение подвижной фазы по пластинке происходит только за счет капиллярных сил, вклад гравитации при этом отсутствует, что повышает эффективность разделения по сравнению с камерами для верти-

кального элюирования.

Подвижные фазы (ПФ)

Подвижные фазы (элюенты) должны быть предпочтительно малоток-

ции ни с сорбентом (НФ, неподвижной фазой), ни с компонентами разделяе-

мой смеси. ПФ должны также достаточно быстро испаряться с поверхности хроматограмм после элюирования.

Для подавления диссоциации полярных молекул компонентов разде-

ляемой смеси к ПФ добавляют вещества кислого или основного характера

(модификаторы).

Нанесение проб

Если это указано в частных фармакопейных статьях, пластинки предва-

рительно промывают растворителем и активируют нагреванием в течение 1 ч

при 100–105 С в сушильном шкафу. Перед нанесением проб пластинки должны храниться в герметично закрытом эксикаторе. Нанесение проб осу-

ществляют:

– калиброванными капиллярами с тупым концом;

– поршневыми микрошприцами с тупым концом иглы;

– полуавтоматическими или автоматическими аппликаторами.

Нанесение осуществляют двумя способами: в виде пятен (2–5 мм диа-

метром) с промежутками между пятнами не менее 10 мм и в виде полос дли-

ной от 10 до 20 мм с промежутком между ними не менее 10 мм. Расстояние линии старта от нижнего края пластинки должно составлять не менее 10 мм.

Во избежание «краевых эффектов» размывания фронта ПФ в процессе элюи-

рования перед нанесением проб соскабливают с обеих боковых сторон пла-

стинки слой сорбента шириной 2–3 мм. Расстояния на стартовой линии от боковых краев пластинки до мест нанесения первой и последней проб долж-

ны составлять не менее 10 мм. В процессе нанесения проб недопустимо по-

вреждение сорбента на линии старта. Подсушивание нанесенных проб осу-

ществляют в токе холодного или теплого воздуха, либо на специальном столе с электроподогревом.

Способы элюирования

Используют следующие способы элюирования: восходящее элюирова-

ние (одно- и многоступенчатое, одномерное и двумерное – с поворотом пла-

стинки на 90 или 180) и горизонтальное.

Восходящая хроматография

Если не указано иначе в частной фармакопейной статье, пластинку с нанесенными пробами помещают вертикально в камеру, предварительно на-

сыщенную парами ПФ в течение 1 ч при 20–25 С. Уровень ПФ должен быть расположен ниже линии старта. Камеру закрывают и проводят процесс при

20–25 С в защищенном от света месте. После прохождения фронта ПФ рас-

стояния, указанного в частной фармакопейной статье, пластинку вынимают из камеры, сушат и проявляют в предписанных условиях.

При проведении двумерной хроматографии пластинку высушивают после хроматографирования в первом направлении и хроматографируют в направлении, перпендикулярном первому.

Горизонтальная хроматография

Пластинку с нанесенными пробами помещают в камеру и направляют по-

ток ПФ из лотка в камеру согласно инструкции к прибору для горизонтального элюирования. Процесс проводят при 20–25 С (если это указано в частной фар-

макопейной статье, одновременно с противоположных сторон пластинки). Ко-

гда ПФ пройдет расстояние, указанное в частной фармакопейной статье, пла-

стинку вынимают, сушат и проявляют в предписанных условиях.

Двумерную хроматографию выполняют как указано в разделе «Восхо-

дящая хроматография».

Способы обнаружения

Обнаружение (детектирование) хроматографических зон после прове-

дения качественной и полуколичественной ТСХ осуществляют следующими способами:

– наблюдением под УФ-светом;

– опрыскиванием растворами обнаруживающих реагентов;

– выдерживанием в парах обнаруживающего реагента;

– погружением в растворы обнаруживающих реагентов в специальных камерах.

Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ)

Эффективность разделения увеличивается как вследствие увеличения площади раздела подвижной и неподвижной фазы за счет уменьшения диа-

метра частиц сорбента, так и благодаря большей однородности размеров этих частиц. Применяют ВЭТСХ-пластинки, выполненные как в нормально-

фазовом (полярная НФ), так и в обращенно-фазовом (неполярная НФ) вари-

По сравнению с классической ТСХ использование высокоэффективных пластинок позволяет:

– увеличить число анализируемых проб за счет уменьшения диаметра стартовых пятен (до 1–2 мм) или длины полос (до 5–10 мм);

– уменьшить промежутки между стартовыми пятнами (до 5 мм);

– уменьшить время хроматографирования за счет уменьшения пробега фронта подвижной фазы (ПФ);

– уменьшить расход (объем) ПФ;

– снизить пределы обнаружения пятен и количественного определения определяемых веществ в 10–100 раз.

Применение ВЭТСХ обеспечивает получение более компактных пятен разделяемых соединений, что улучшает метрологические характеристики коли-

чественного определения с помощью сканирующей хроматоденситометрии.

Вместо пластинок с нанесенным тонким слоем сорбента можно использовать специальную хроматографическую бумагу в виде листов или полосок. Хроматографическая бумага должна быть химически чистой, нейтральной, инертной по отношению к компонентам раствора и подвижной фазе и быть однородной по плотности; имеют значение структура молекул целлюлозы в бумаге, ориентация волокон и другие свойства, влияющие на скорость движения подвижной фазы. Основные операции в бумажной хроматографии проводятся примерно так же, как и в тонкослойной.

Для разделения водорастворимых веществ, например, неорганических ионов, в качестве подвижной фазы обычно берут органический растворитель, а в качестве неподвижной – воду (бумагу заранее смачивают водой). Для разделения компонентов, хорошо растворимых в органических растворителях, гидрофильную бумагу превращают в гидрофобную, пропитывая ее растворами органических веществ (парафина, растительного масла и др.), а в качестве подвижной фазы используют воду, водный раствор какой-либо кислоты или щелочи, буферный раствор.

Растворители подвижной и неподвижной фаз не должны смешиваться, состав растворителя в процессе хроматографирования не должен изменяться, растворители должны легко удаляться с бумаги. Индивидуальные растворители используются достаточно редко. Чаще для этой цели применяют смеси веществ, например, бутилового или амилового спирта с метиловым или этиловым, смеси бутилового спирта с уксусной кислотой, аммиаком и др.

По технике выполнения различают следующие виды бумажной хроматографии: одномерную, двумерную, круговую и электрофоретическую . Для получения двумерных хроматограмм хроматографирование проводят дважды: после обработки пробы одним растворителем хроматограмму поворачивают на 90° и хроматографируют вторично уже другим растворителем. Такая методика позволяет проводить более тонкие разделения компонентов смеси. Специфическим приемом является сочетание БХ и электрофореза. Для этого к влажному листу хроматографической бумаги прикладывают постоянное электрическое напряжение. Дополнительное воздействие электрического поля приводит к более четкому разделению, особенно для ионов с разными зарядами. Электрофорез можно проводить одновременно с хроматографированием, а также до или после хроматографирования.

Качественный состав пробы в методе бумажной распределительной хроматографии так же, как и в ТСХ, может быть установлен или по специфической окраске отдельных пятен на хроматограмме, или по численному значению R f каждого компонента. Количественные определения в БХ выполняются по хроматографическим характеристикам (по площади пятна на хроматограмме и интенсивности его окраски) или после вымывания подходящим физико-химическим методом. Отметим, что метод бумажной хроматографии, предложенный в 1941 г. Мартином и Синджем, в настоящее время используют в аналитических лабораториях довольно редко.

Вопросы для самоконтроля

Каковы преимущества двумерной хроматографии перед одномерной бумажной или ТСХ?

Как идентифицировать пятна органических соединений в методе ТСХ?

Как выполняют количественный анализ в методе ТСХ?

Как определяют R f в методе БХ и ТСХ? От чего зависит величина R f и какие условия нужно поддерживать постоянными при проведении эксперимента?

Как можно определить концентрации компонентов смеси после разделения методом БХ или ТСХ?

Как выполняется качественный анализ с помощью плоскостных вариантов хроматографии – БХ и ТСХ?

Какими способами проба анализируемой смеси веществ вводится в хроматографическую установку в бумажной хроматографии?

Почему в методе ТСХ необходимо герметически закрывать камеру с растворителем и пластинкой во время подъема фронта растворителя?

Как обнаруживают и идентифицируют компоненты на бумажных и тонкослойных хроматограммах?

Каковы области применения, достоинства и недостатки тонкослойной хроматографии?

РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ. БУМАЖНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (ХРОМАТОГРАФИЯ НА БУМАГЕ)

Распределительная хроматография основана на использовании различий в растворимости распределяемого вещества в двух контактирующих несмешивающихся жидких фазах. Обе фазы - ПФ и НФ - представляют собой жидкие фазы. При перемещении жидкой ПФ вдоль жидкой же НФ хроматографируемые вещества непрерывно перераспределяются между обеими жидкими фазами.

К распределительной хроматографии относится бумажная хроматография (или хроматография на бумаге) в ее обычных вариантах. В этом методе вместо пластинок с тонким слоем сорбента, употребляемых при ТСХ, применяют специальную хроматографическую бумагу, по которой, пропитывая ее, перемещается жидкая ПФ во время хроматографирования от линии старта до линии финиша растворителя.

Различают нормальнофазовую и обращеннофазовую бумажную хроматографию.

В варианте нормальнофазовой бумажной хроматографии жидкой НФ является вода, сорбированная в виде тонкого слоя на волокнах и находящаяся в порах гидрофильной бумаги (до 25% по массе). Эта связанная вода по своей структуре и физическому состоянию сильно отличается от обычной жидкой воды. В ней и растворяются компоненты разделяемых смесей.

Роль ПФ, перемещающейся по бумаге, играет другая жидкая фаза, например, органическая жидкость с добавлением кислот и воды. Жидкую органическую ПФ перед хроматографированием насыщают водой для того, чтобы ПФ не растворяла в себе воду, сорбированную на волокнах гидрофильной хроматографической бумаги.

Хроматографическая бумага выпускается промышленностью. Она должна отвечать ряду требований: готовиться из высококачественных волокнистых сортов хлопка, быть однородной по плотности и толщине, по направлению ориентирования волокон, химически чистой и инертной по отношению к НФ и разделяемым компонентам.

В нормальнофазовом варианте в качестве ПФ чаще всего применяют жидкие смеси, составленные из различных растворителей. Классическим примером такой ПФ является смесь уксусной кислоты, н-бутанола и воды в объемном отношении 1:4:5. Используют и такие растворители, как этилацетат, хлороформ, бензол и т. д.

В варианте обращеннофазовой бумажной хроматографии жидкая НФ представляет собой органический растворитель, тогда как в роли жидкой ПФ выступает вода, водные или спиртовые растворы, смеси кислот со спиртами. Процесс проводят с использованием гидрофобной хроматографической бумаги. Её получают обработкой (пропиткой) бумаги нафталином, силиконовыми маслами, парафином и т. д. Неполярные и малополярные органические растворители сорбируются на волокнах гидрофобной бумаги и проникают в ее поры, образуя тонкий слой жидкой НФ. Вода не удерживается на такой бумаге не смачивает ее.

Техника бумажной хроматографии в общих чертах такая же, как и в методе ТСХ. Обычно на полоску хроматографической бумаги на линию старта наносят кашпо анализируемого раствора, содержащего смесь разделяемых веществ. После испарения растворителя бумагу ниже линии старта погружают в ПФ, располагая бумагу вертикально (подвешивая ее). Закрывают камеру крышкой и проводят хроматографирование до тех пор, пока ПФ не достигнет обозначенной на бумаге линии фронта растворителя. После этого процесс прерывают, бумагу сушат на воздухе и проводят детектирование пятен и идентификацию компонентов смеси.

Бумажная хроматография подобно методу ТСХ применяется как в качественном, так и в количественном анализе.

Для количественного определения содержания того или иного компонента смеси применяют различные методы:

• 1) исходят из наличия определенной зависимости (пропорциональной, линейной) между количеством вещества в пятне и площадью пятна (часто при этом предварительно строят градуировочный график);
• 2) взвешивают вырезанное пятно с веществом и такую же по площади чистую бумагу, а затем по разности находят массу определяемого вещества;
• 3) учитывают связь между интенсивностью окраски пятна и содержания в нем определяемого компонента, придающего окраску пятну.

В ряде случаев вещества, содержащиеся в пятнах, экстрагируют каким-либо растворителем и затем анализируют экстракт.

Бумажная хроматография - фармакопейный метод, используется для разделения смесей, содержащих как неорганические, так и органические вещества. Метод доступен, прост по выполнению, однако в целом он уступает более современному методу ТСХ, в котором применяется тонкий слой сорбента.

Метод хроматографии на бумаге относится к плоскостной хроматографии, он основан на распределении анализируемых веществ между двумя несмешивающимися жидкостями.

В распределительной хроматографии разделение веществ происходит вследствие различия коэффициентов распределения компонентов между двумя несмешивающимися жидкостями. Вещество присутствует в обеих фазах в виде раствора. Неподвижная фаза удерживается в порах хроматографической бумаги, не взаимодействуя с ней, бумага выполняет функцию носителя неподвижной фазы.

Виды хроматографической бумаги:

1) гидрофильная бумага удерживает в порах до 22 % воды; неподвижная фаза – вода, подвижная – органический растворитель; такая бумага применяется для определения водорастворимых веществ.

2) гидрофобная бумага отталкивает воду, поэтому ее пропитывают неполярным органическим растворителем (неподвижная фаза); подвижная фаза – вода; такая бумага применяется для определения нерастворимых в воде соединений (жирорастворимые кислоты, витамины).

К хроматографической бумаге предъявляются следующие требования:

¨ химическая чистота;

¨ химическая и адсорбционная нейтральность по отношению к анализируемым веществам и подвижной фазе;

¨ однородность по плотности;

¨ одинаковая направленность волокон.

Для получения хроматограммы на бумагу наносят каплю анализируемой смеси. Бумагу помещают в хроматографическую камеру, ее конец погружают в сосуд с элюентом. Растворитель продвигается по бумаге, смесь анализируемых веществ распределяется между подвижной и неподвижной фазами и разделяется на бумаге в виде пятен или полос. Положение зон компонентов определяют проявлением хроматографической бумаги соответствующими реагентами, которые с компонентами разделяемой смеси образуют окрашенные соединения.

Для количественной оценки способности разделения веществ в хроматографической системе применяют коэффициент распределения К р – отношение концентрации вещества в неподвижной и подвижной фазах. Экспериментальное установление коэффициентов распределения в данном методе невозможно, для оценки способности разделения веществ на бумаге применяют коэффициент смещения (подвижности) R f . Коэффициент смещения равен отношению скорости движения вещества () к скорости движения подвижной фазы (). Экспериментально величину R f находят как отношение расстояния Х, пройденного веществом, к расстоянию Х f , пройденному растворителем от старта до линии фронта:

.

Коэффициент R f изменяется в пределах 0 – 1,00. Величина R f зависит от природы определяемого вещества, вида хроматографической бумаги, качества и природы растворителя, способа нанесения пробы, техники эксперимента и температуры. Коэффициент R f не зависит от концентрации определяемого вещества и присутствия других компонентов.

Идентификацию по хроматограмме выполняют следующими способами:

¨ визуальным сравнением характерной окраски зон веществ на исследуемой и стандартной хроматограммах;

¨ измерением коэффициентов подвижности R f для стандартного и анализируемого вещества в определенном растворителе. Хроматографирование и установление R f для исследуемой и стандартной смесей проводят на одинаковой бумаге и в одной камере в строго идентичных условиях. Сопоставляя коэффициенты R f , делают заключение о присутствии в анализируемой смеси тех или иных компонентов.

Количественное определение выполняют непосредственно по хроматограмме или при вымывании (элюировании) анализируемого вещества с бумаги.

Способы количественного анализа:

¨ визуальное сравнение интенсивности окраски пятен на исследуемой и стандартной хроматограммах (полуколичественное определение, точность 15 –20 %);

¨ измерение площади пятна, образованного данным компонентом, и нахождение концентрации вещества по градуировочному графику, построенному для серии стандартных растворов в координатах: площадь пятна – концентрация вещества; точность определения 5 – 10 %;

¨ элюирование определяемого вещества с поверхности хроматограммы и спектрофотометрическое или флуориметрическое измерение оптической плотности элюата (А); концентрацию вещества в растворе рассчитывают по формуле:

где К – коэффициент пропорциональности; S – площадь пятна, измеренная предварительно, мм 2 ; точность определения 1 %.

По способу хроматографирования различают восходящую (рис. 21), нисходящую (рис. 22), круговую (рис. 23), градиентную и двухмерную хроматографии.

Метод хроматографии на бумаге широко применяется для определения неорганических соединений, аминокислот, аминов, белков, углеводов, жирных кислот, фенолов, витаминов в химической, пищевой, фармацевтической промышленности, медицине, биохимии.

Метод нашел применение в анализе практически всех пищевых продуктов: в сахарном производстве – для определения углеводов; в хлебопекарном и кондитерском – аминокислот, органических кислот, углеводов, полисахаридов и карбонильных соединений; в виноделии – органических кислот и аминокислот; в производстве молока и молочных продуктов – аминокислот; в мясоперерабатывающей промышленности – фенолов, жирных и летучих кислот, аминокислот и карбонильных соединений.